7ª PRÁCTICA

PRÁCTICA Nº 7: "GLUCOSA-HK"
Método: "Hexokinasa. Enzimático-UV"
Fecha: 23/10/19

PRINCIPIO DEL MÉTODO
La hexokinasa (HK) cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6- fosfato (G6F). La glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-DH) con reducción paralela de NAD a NADH:
Glucosa + ATP ---> Glucosa-6-fosfato +  ADP (por HK)
G6F + NAD+ ---> 6-Fosfogluconato + NADH + H+ (por G6F-DH)
El aumento en la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO
La glucosa es la mayor fuente de energía para las células del organismo; la insulina facilita la entrada de glucosa en las células.
La diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con una hiperglucemia, causada por un déficit de insulina.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS

• R1 (Tampón): TRIS pH 7,5 -  ATP - Mg2+.
• R2 (Enzimas): NAD+ - Hexoquinasa (HK) - Glucosa-6-fosfato (G6F-DH).
• GLUCOSE CAL: Calibrador primario de Glucosa 100 mg/dL.
  

PREPARACIÓN
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R2 Enzimas en un frasco de R1 Tampón.

Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad (RT): 1 mes en nevera (2-8ºC) o 7 días a Temperatura ambiente (15-25ºC).

APARATAJE

• Colorímetro utilizado en prácticas anteriores.
• Baño María para atemperar los reactivos a 37ºC.

MATERIALES

• Pipeta automática de 1000 microlitros y puntas azules.
• Pipeta automática de 10 microlitros y puntas amarillas.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros.
• Tubo de orina como "contenedor" de desechos.
• Gradilla.
• Tubos de ensayo de 3 ml.
• Tapones azules para los tubos de ensayo.
• Cubetas de 1'0 cm de paso de luz.
  
  
  

MUESTRA

• Suero libre de hemólisis.
  

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar preparar el reactivo de trabajo (RT).
2. Encender el espectrofotómetro y ajustarlo a 0 frente a agua desilada.
3. Poner 1000 microlitros (=1'0 ml)  del RT en el tubo que hemos rotulado previamente como "Blanco", otros 1000 microlitros en el tubo Patrón y otro mililitro en la Muestra. Todo ello con ayuda de la pipeta de 1000 microlitros y las puntas azules.
   
   
   
4. Depositar 10 microlitros de Patrón el tubo "Patrón" con la pipeta de 10 microlitros y las puntas amarillas.
   
   
   
5. Echar 10 microlitros del suero en el tubo de "Muestra".
6. Mezclar el tubo de "Muestra" e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño termostático.
   
7. Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo con las cubetas de fotometría.

CÁLCULOS
((A) Muestra: (A) Patrón) x 100 (Conc. Patrón) = mg/dL de glucosa en la muestra.

RESULTADOS

• Absorbancia del Patrón: 0'356 A.
  
• Absorbancia de la Muestra: 0'962 A.

(0'962 A: 0'356 A) x 100 = 270'22 mg/dL

OBSERVACIONES

• El calibrador es lo mismo que el patrón (GLUCOSE CAL).
• Hemos realizado la práctica por turnos: cada uno metía su muestra correspondiente en el baño María a los 3 minutos de haberla metido el anterior compañero en el baño.
• Realizar la medición de la absorbancia (A) de la Muestra lo más rápido posible, ya que ésta va aumentando conforme va pasando el tiempo.
• No hace falta incubar el Blanco porque no produce reacción.
• No olvidar de limpiar las paredes lisas de las cubetas antes de realizar la medición en el espectrofotómetro o en el colorímetro (como es en mi caso).
• Utilizar una punta de pipeta distinta cada vez que tratemos cada reactivo o muestra.

NOTAS

• GLUCOSE CAL: Debido a la naturaleza del producto,es aconsejable tratarlo con sumo cuidado ya que se puede contaminar con facilidad.
• La calibración con el patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos. En este caso, se recomienda utilizar calibradores séricos.
• Usar puntas de pipeta desechables limpias para su dispensación.