8ª PRÁCTICA
PRÁCTICA Nº 8: "SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA"
Fecha: 24/10/19
OBJETIVO
Uno de los problemas más comunes en los estudios o análisis bioquímicos consiste en separar los componentes de una mezcla y, opcionalmente, identificar dichos componentes. La cromatografía permite realizar dicha separación e identificación.
Hay enfermedades clínicas en la que se produce una alta concentración de aminoácidos en el plasma y la orina. Este desequilibrio en la sangre se denomina aminoaciduria. Algunas de estas enfermedades son: fenilcetonuria, cistinuria o la enfermedad de Hartnup.
Uno de los análisis empleados para la detección de aminoácidos en una muestra biológica es la cromatografía en capa fina.
FUNDAMENTOS
La cromatografía en capa fina es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un adsorbente idóneo (fase estacionaria).
La fase estacionaria está dispuesta en una fina lámina que está cubriendo un soporte de vidrio o plástico. El material empleado en la fase estacionaria depende del tipo de muestras a separar. Para separar aminoácidos se utilizan gel de sílice, alúmina, almidón y geles de celulosa. La fase móvil también depende del tipo de moléculas a separar, utilizándose disolventes o mezclas de disolvente de diferente polaridad.
Las muestras se aplican en un extremo de la lámina de gel. A continuación, se coloca la lámina en posición vertical sobre un disolvente apropiado que ascenderá por capilaridad arrastrando las muestras. Las moléculas que se han separado y ocupan diferentes posiciones, pueden ser observadas utilizando un revelador que las coloree.
Representación de una cromatografía en capa fina ascendente:
Las muestras migran desde la base del gel arrastradas por el disolvente (A). Finalizada la cromatografía, las diferentes bandas separadas se colorean con un revelador (B).
APARATAJE
La esterilización que se efectúa en la estufa se denomina de calor seco y se realiza a 180°C durante 2 horas normalmente; la cristalería, al ser calentada por aire a alta temperatura, absorbe humedad y elimina la posibilidad de que se mantenga cualquier actividad biológica debido a las elevadas temperaturas y a los tiempos utilizados.
En cada patrón de aminoácido obtendremos una mancha característica. En la mezcla problema, obtendremos tantas manchas como aminoácidos existan en ella. La posición de los patrones nos ayudará a identificar los aminoácidos de la muestra.
También podemos identificar los aminoácidos de la mezcla mediante un parámetro cromatográfico denominado relación frente al solvente. La relación frente al solvente (Rf) o migración relativa de una sustancia en una fase móvil (disolvente) y estacionaria (gel) determinada va a ser constante. Esta característica nos permite mediante la comparación con patrones, la identificación de la sustancia de la mezcla. El valor del recorrido relativo (Rf) de un compuesto es una medida de la migración de este compuesto comparado con la migración del eluyente.
Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen (cm) : distancia recorrida por el eluyente desde el origen (cm).
Cada una de las manchas de la mezcla de aminoácidos obtenidas puede identificarse comparando su migración con las manchas de los patrones. El valor del recorrido relativo (Rf) de cada aminoácido es el mismo cuando está en una mezcla de aminoácidos que cuando está solo.
Fecha: 24/10/19
OBJETIVO
- Realizar una separación e identificación de los aminoácidos triptófano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra mediante una cromatografía de capa fina ascendente.
Uno de los problemas más comunes en los estudios o análisis bioquímicos consiste en separar los componentes de una mezcla y, opcionalmente, identificar dichos componentes. La cromatografía permite realizar dicha separación e identificación.
Hay enfermedades clínicas en la que se produce una alta concentración de aminoácidos en el plasma y la orina. Este desequilibrio en la sangre se denomina aminoaciduria. Algunas de estas enfermedades son: fenilcetonuria, cistinuria o la enfermedad de Hartnup.
Uno de los análisis empleados para la detección de aminoácidos en una muestra biológica es la cromatografía en capa fina.
FUNDAMENTOS
La cromatografía en capa fina es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un adsorbente idóneo (fase estacionaria).
La fase estacionaria está dispuesta en una fina lámina que está cubriendo un soporte de vidrio o plástico. El material empleado en la fase estacionaria depende del tipo de muestras a separar. Para separar aminoácidos se utilizan gel de sílice, alúmina, almidón y geles de celulosa. La fase móvil también depende del tipo de moléculas a separar, utilizándose disolventes o mezclas de disolvente de diferente polaridad.
Las muestras se aplican en un extremo de la lámina de gel. A continuación, se coloca la lámina en posición vertical sobre un disolvente apropiado que ascenderá por capilaridad arrastrando las muestras. Las moléculas que se han separado y ocupan diferentes posiciones, pueden ser observadas utilizando un revelador que las coloree.
Representación de una cromatografía en capa fina ascendente:
Las muestras migran desde la base del gel arrastradas por el disolvente (A). Finalizada la cromatografía, las diferentes bandas separadas se colorean con un revelador (B).
APARATAJE
- Horno de desecación.
La esterilización que se efectúa en la estufa se denomina de calor seco y se realiza a 180°C durante 2 horas normalmente; la cristalería, al ser calentada por aire a alta temperatura, absorbe humedad y elimina la posibilidad de que se mantenga cualquier actividad biológica debido a las elevadas temperaturas y a los tiempos utilizados.
- Placa de gel de celulosa de 20 x 5 cm.
- Regla: para medir los centímetros de la placa mencionada anteriormente, ya que la debemos de recortar de manera que obtengamos 2 trozos de ella con medidas de 10 x 5 cm cada una.
- Lápiz: para señalar la placa justo por la mitad (10 cm) después de haber medido con la regla o la placa de gel de celulosa.
- Tijeras: para recortar la placa.
- Pipeta automática de 1-10 microlitros.
- Puntas de pipeta de filtro.
- Tubo de orina: "contenedor de desechos".
- Gradilla para colocar los tubos eppendorf.
- Vidrio de reloj: lo usaremos como tapadera.
- Vaso de precipitados de 600 ml.
- Rotulador permanente rojo: para marcar la línea en el vaso de precipitados una vez medidos los 1'5 cm desde la base del recipiente hacia arriba.
- Báscula electrónica para medir los 0'2 gramos de Ninhidrina.
- Espátula.
- Papel de aluminio.
- Probeta de 100 ml para realizar la disolución de Ninhidrina + Acetona.
- Embudo.
- Pipeta Pasteur para enrasar los 100 ml de Acetona.
- Soporte de vidrio o cristal.
- Tubo eppendorf blanco con una mezcla de aminoácidos (Arginina, ácido Glutánico y Fenilalanina) que actúa como Patrón.
- Tubo eppendorf amarillo con un aminoácido desconocido (Muestra).
- Acetona: Compuesto orgánico líquido, incoloro, de olor agradable, inflamable y volátil, que se obtiene a partir del acetato de calcio, del ácido acético o de los gases procedentes del petróleo.
- Ninhidrina: Agente reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía.
- Fase móvil: compuesta por 200 ml de Butanol, 50 ml de Ácido Acético, 50 ml de Acetona y 50 ml de agua.
- En primer lugar, recortar la placa de gel de celulosa de medidas 20 x 5 cm por la mitad (con ayuda de unas tijeras) de manera que obtengamos dos partes de ésta. Cada una de ellas con las siguientes medidas: 10 x 5 cm.
- Una vez obtenida la placa de gel de celulosa de 10 x 5 cm, con un lápiz muy blando para no dañar el gel, medir 1'5 cm desde la base de la placa y realizar una línea horizontal con la placa situada en posición vertical.
- Marcar los puntos donde se aplicarán las muestras. Estos puntos deben estar separados entre sí 1 cm y a 1'5 cm de la base de la placa, es decir, los colocaremos sobre la línea realizada previamente.
- Con la placa en posición horizontal, aplicar 3 microlitros de la muestra y patrones de aminoácidos apoyando suavemente la punta de la micropipeta sobre el punto señalado en la celulosa. Esta operación debe hacerse aplicando y secando la misma muestra varias veces, para evitar una excesiva superficie del punto de aplicación.
Nota: Cada gota debe tener un diámetro de unos 3 mm aproximadamente. - Una vez que las manchas se hayan secado al aire, colocar la fase móvil en el vaso de precipitados de 600 ml de forma que cubra el fondo hasta una altura máxima de 1 cm (marcar con el permanente rojo más o menos por dónde quedaría el cm con la regla).
- Introducir la placa verticalmente en el vaso de precipitados de forma que las muestras queden en la base del recipiente. Además, siempre se debe cuidar que los puntos de aplicación queden por encima del nivel de la fase móvil (disolvente). Colocar el vidrio de reloj sobre el vaso de precipitados (para evitar la evaporación) y dejar que el disolvente suba por capilaridad durante 35 minutos.
- Mientras esperamos, preparar el revelador de ninhidrina. Para ello, se requerirán 0'2 gramos de Ninhidrina en 100 ml de Acetona. Para realizar este paso del procedimiento, nos ayudaremos de la báscula electrónica, espátula, papel de aluminio (sobre el que colocaremos la ninhidrina), de la probeta de 100 ml y del embudo, y posteriormente de una pipeta Pasteur para enrasar. Una vez preparado, depositar la disolución en un pulverizador.
- Cuando hayan transcurrido los 35 minutos, sacar la placa del vaso de precipitados, marcar con un lápiz el frente del solvente, es decir, hasta donde ha llegado la fase móvil, colocar las placas sobre el soporte de vidrio o cristal e introducirlas en el horno de desecación para secarlas. Dejar la puerta abierta del horno mientras se secan las placas.
- Con la placa perfectamente seca y en posición vertical, pulverizarla con el revelador de Ninhidrina previamente preparado. La pulverización debe hacerse suave y uniformemente. Debe evitarse el exceso de pulverización, pero no hay que intentar quitar revelador si se aplica demasiado. Esta operación, la hemos realizado en la puerta del laboratorio para no inhalar el pulverizado.
- Calentar la placa unos 10 minutos a 110ºC en el horno de desecación. Las manchas de los aminoácidos de color rosáceo aparecerán distribuidas a lo largo del gel.
En cada patrón de aminoácido obtendremos una mancha característica. En la mezcla problema, obtendremos tantas manchas como aminoácidos existan en ella. La posición de los patrones nos ayudará a identificar los aminoácidos de la muestra.
También podemos identificar los aminoácidos de la mezcla mediante un parámetro cromatográfico denominado relación frente al solvente. La relación frente al solvente (Rf) o migración relativa de una sustancia en una fase móvil (disolvente) y estacionaria (gel) determinada va a ser constante. Esta característica nos permite mediante la comparación con patrones, la identificación de la sustancia de la mezcla. El valor del recorrido relativo (Rf) de un compuesto es una medida de la migración de este compuesto comparado con la migración del eluyente.
Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen (cm) : distancia recorrida por el eluyente desde el origen (cm).
Cada una de las manchas de la mezcla de aminoácidos obtenidas puede identificarse comparando su migración con las manchas de los patrones. El valor del recorrido relativo (Rf) de cada aminoácido es el mismo cuando está en una mezcla de aminoácidos que cuando está solo.
- Hemos colocado 6 placas de gel de celulosa por cada soporte de vidrio o cristal.
- La placa se debe manipular con guantes y cogiéndola por los bordes ya que las huellas de los dedos podrían aparecer posteriormente como confusas manchas coloreadas.
- La muestra problema y los patrones se deben conservar congelados (-20ºC).
- La solución de Ninhidrina una vez preparada caduca a los 6 meses.
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