6ª PRÁCTICA

PRÁCTICA Nº 6: "GLUCOSA OXIDASA"
Fecha: 17/10/19

PRINCIPIO DEL MÉTODO
La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno (H202), producido se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxigeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD):
Beta-D-Glucosa + O2 + H20 --> Ácido glucónico + H2O2 (gracias a la acción de GOD)
H2O2 + Fenol + Ampirona --> Quinona + H2O (gracias a la acción de POD)
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO
La glucosa es la mayor fuente de energía para las células del organismo; la insulina facilita la entrada de glucosa en las células.
La diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con una hiperglucemia, causada por déficit de insulina.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

APARATAJE

• Espectrofotómetro utilizado en prácticas anteriores.
• Baño termostático o baño María: para calentar las muestras a la temperatura deseada.

REACTIVOS

• R1 (Tampón): TRIS pH 7,4 (92 mmol/L) y Fenol (0,3 mmol/L).
• R2 (Enzimas): Glucosa oxidasa (GOD) (15000 U/l), Peroxidasa (POD) (1000 U/L), 4- Aminofenazona (4-AF) (2,6 mmol/L).
• GLUCOSA CAL: Patrón primario acuoso de Glucosa (100 mg/dL).

PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE TRABAJO (RT)
- Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampón.
- Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8ºC) o 7 días a Temperatura ambiente (15-25ºC).

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso.
 No usar reactivos fuera de la fecha indicada.
Indicadores de deterioro de los reactivos:
- Presencia de partículas y turbidez.
- Absorbancia (A) del blanco a 505 nm  >  0,10.

MATERIALES

• Gradilla.
• Pipeta automática de 10 microlitros y puntas amarillas.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas de pipeta azules.
• Tubo de orina (contenedor de desechos).
• 7 tubos de ensayo de 3 mL cada uno.
• Pipetas Pasteur.
• 3 cubetas de fotometría (de 1'0 cm de paso de luz) por persona para tenerlas cada uno guardadas en un tubo de orina rotulado con nuestro nombre.
  
• Tapones para tubos de ensayo.
  

MUESTRA

• Suero libre de hemólisis y LCR.

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar preparar el reactivo de trabajo (RT). Para ello, disolver el contenido del R2 en el frasco de R1.
   
   
   
   
   
2. Encender el espectrofotómetro y ajustarlo a 0 frente a agua destilada.
   
3. Depositar 1000 microlitros (=1,0 mL) del reactivo de trabajo (RT) preparado previamente en el tubo donde vayamos a realizar el "Blanco", otros 1000 microlitros en el tubo que hayamos rotulado como "Patrón" y otros 1000 microlitros de RT al tubo de la muestra de cada uno. Todo ello con la pipeta automática de 100-1000 microlitros.
4. A continuación, al tubo del "Patrón" le echaremos 10 microlitros del patrón (GLUCOSA CAL) con la pipeta automática de 10 microlitros.
   
   
   
   
   
5. Y al tubo de la "Muestra" le añadiremos 10 microlitros de suero.
   
   
   
   
   
6. Cerrar los tubos de ensayo con tapones.
7. Incubar 10 minutos a 37ºC en el baño María todos los tubos preparados.
   
   
   
   
   
8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.
   
   
   

CÁLCULOS
[(A) Muestra : (A) Patrón] x100 (Conc. Patrón) = mg/dL de glucosa en la muestra

RESULTADOS

• Absorbancia (A) de la muestra: 0'801 A
• Absorbancia (A) del Patrón: 0'331 A

(0'801 A: 0'331 A) x 100 = 241'99 mg/dL de glucosa en la muestra.

 

OBSERVACIONES

• Hemos realizado 1 muestra por persona del grupo, mientras que sólo hemos hecho un "Blanco" y un "Patrón" por mesa.

CONTROL DE CALIDAD
Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados: SPINTROL H Normal y Patológico.
Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, revisar el instrumento, reactivos y el calibrador.
Cada laboratorio debe disponer de su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles.

VALORES DE REFERENCIA
Suero o plasma:
60-110 mg/dL
LCR:
60-80% del valor en sangre
 Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

INTERFERENCIAS
No se han observado interferencias con: hemoglobina hasta 4g/L, bilirrubina hasta 20 mg/L, creatinina hasta 100 mg/L, galactosa hasta 1 g/L.

NOTAS

1. GLUCOSE CAL. Debido a la naturaleza del producto, es aconsejable tratarlo con sumo cuidado ya que se puede contaminar con facilidad.
2. La calibración con el Patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos. En este caso, se recomienda utilizar calibradores séricos.
3. Usar puntas de pipeta desechables limpias para su dispensación.
4. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este reactivo en distintos analizadores.