1ª PRÁCTICA

PRÁCTICA Nº1: "CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN Y MANEJO DEL ESPECTROFOTÓMETRO"
Fecha: 19/09/19

OBJETIVOS
Se pretenden utilizar dos colorantes como analitos con capacidad cromógena para elaborar sendas baterías de dilución seriadas. Con ellas realizaremos medidas espectrofotométricas, elaboraremos las correspondientes curvas de calibración y calcularemos la concentración de diversas disoluciones problema. Además, aprenderemos a manejar los programas "Excell" y "Spectra Analysis" (del ordenador) para la realización de las curvas de calibración.

UTILIDAD CLÍNICA
Esta práctica nos ayudará a manejar el espectrofotómetro, practicar a la hora de realizar cálculos de diluciones y la realización de una curva de calibración a través del programa de "Excel" y manual.

FUNDAMENTOS
La espectrofotometría es un principio básico de las principales técnicas instrumentales que se usan en el laboratorio de bioquímica.

Un gran número de las determinaciones que se realizan habitualmente en el laboratorio de bioquímica (LBQ) se basan en la medida de la interacción de la materia (analito) con un espectro de energía radiante; dicha interacción puede dar lugar a respuestas diferentes por parte del analito (absorción, emisión, transmisión, dispersión, refracción y/o reflexión), lo que origina distintos tipos de técnicas. La energía radiante se obtiene a partir de una fuente luminosa/calorífica/química (lámpara, llama o reacción química). Puesto que la energía radiante utilizada en dichas técnicas es de tipo electromagnético y está formada por una sucesión de fotones dotados de movimiento ondulatorio, todas estas técnicas se agrupan bajo la denominación de ESPECTROFOTOMETRÍA.

En este caso se trata de una ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR, que puede definirse como "un método que mide la concentración de un analito en una muestra basándose en la capacidad de dicho analito para absorber luz de una determinada longitud de onda al ser excitado por una radiación electromagnética".

Cuando un haz de luz incide sobre una muestra problema, esta absorbe radiación de una determinada longitud de onda(COLOR ABSORBIDO); el resto de las radiaciones serán transmitidas y aparecerá a la vista un color que no es sino la suma de las longitudes de onda que no han sido absorbidas; a este color se le denomina COMPLEMENTARIO.
Existen moléculas o partes de moléculas que, al interaccionar con una radiación electromagnética, absorben parte de su energía y experimentan saltos en sus electrones desde unas órbitas a otras más alejadas del núcleo (excitación). A estas moléculas se les denomina ESPECIES ABSORBENTES, o también CROMÓFOROS o CROMÓGENOS.

La ley de Lambert-Beer tiene una aplicación práctica: nos permite determinar métodos experimentales a partir de los cuales averiguar la concentración de una sustancia de interés en una disolución. Efectivamente, basándonos en la relación lineal existente entre absorbancia y concentración, podemos conocer esta última a través de una CURVA DE CALIBRACIÓN:

Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia frente a concentración. El método de trabajo consiste en medir varias disoluciones de distintas concentraciones conocidas (patrón a diversas diluciones) y determinar sus absorbancias. Los valores obtenidos se trasladan a la gráfica y se obtienen unos puntos a partir de los cuales se traza la curva de calibración (que debe ser rectilínea). Cuando trabajamos con una disolución problema, su absorbancia se traslada a la recta, lo que nos permite obtener su concentración.    
  
APARATAJE

• Espectrofotómetro de absorción: GENESYS 10uv, Thermo Scientific

Es el instrumento que se utiliza para las medidas de absorción de las REM (radiaciones electromagnéticas). Mide la absorbancia (A) en función de la concentración del cromógeno.
Componentes:

• Fuente estable de energía radiante.
• Rejillas de entrada y salida.
• Selector de longitud de onda.
• Portacubetas y cubetas.
• Detector de energía radiante.
• Medidor-presentador de datos.

Modo de uso:

• Conectar el aparato a la red y encender la lámpara (puede ser necesario un tiempo de espera para que la emisión luminosa se estabilice).
• Seleccionar la longitud de onda deseada.
• Realizar el blanco con objeto de eliminar interferencias; para ello ajustamos a 0 la absorbancia con uno de los siguientes métodos:
  • Utilizando un blanco de muestra: muestra diluida en un solvente inerte (elimina las interferencias producidas por la cubeta y la muestra: hemólisis, lipemia, bilirrubina, urobilina, etc.).
  • Utilizando un blanco de reactivo: reactivos sin muestra (elimina las interferencias que pudiera producir la cubeta y el reactivo).
•  Medir la absorbancia de patrones y muestras, haciendo los cálculos necesarios para obtener concentraciones.
• Apagar la lámpara y desenchufar el aparato de la corriente eléctrica. 

Principales problemas:
Los aparatos deben mantenerse limpios y evitar los agentes que produzcan cualquier interferencia en el sistema fotométrico (polvo, líquidos derramados, etc.). Las fluctuaciones bruscas de la luz afectan al sistema óptico del aparato, que sufre con ellas; por otro lado, hay que vigilar el estado de la lámpara, puesto que experimenta un desgaste con el tiempo (lo que obliga a calibrarlo periódicamente). Las cubetas a usar deben estar perfectamente limpias y su superficie no debe presentar rayadura alguna; no se deben tocar con los dedos las caras de la cubeta por las que haya de incidir el rayo de luz. Una vez formado el cromógeno, debemos proceder a su lectura lo más rápidamente posible, ya que el color resultante puede degradarse por exposición a la luz ambiental.   

MATERIALES

• Erlenmeyer con cromógeno 1, de concentración 800 mg/dL.
• Erlenmeyer con cromógeno 2, de concentración 600 mg/dL.
• Agua destilada.
• Pipetas manuales:10 ml, 5 ml, 2 ml
• 9 tubos de ensayo de ensayo de plástico de 10 ml cada uno.
• Gradilla (para colocar los tubos).
• Papel parafilm.
• Tubo de orina (que lo usaremos como contenedor de desechos).
• Cubetas de espectrofotometría.

REACTIVOS
Esta práctica no precisa de reactivos, ya que sólo serán necesarios ambos cromógenos y agua destilada.

CÁLCULOS

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, conectaremos el espectrofotómetro a la red y encenderemos la lámpara, ya que requiere un tiempo para que la emisión luminosa se estabilice.
2. Mientras esperamos a que el espectrofotómetro esté en buenas condiciones para medir las absorbancias, realizaremos 2 baterías de dilución seriadas:
   - Cromógeno 1: AZUL, de concentración 800 mg/dL y cuyo factor de dilución será 1/2: Esta batería de dilución seriada consta de 5 tubos de ensayo (con 10 ml de capacidad cada uno).  Se realizaría del siguiente modo:
   a) Depositar 4 ml (volumen final) de agua destilada en 4 tubos de ensayo (2º,3º,4º,5º tubo) con una pipeta de 5 ml.
   b) En el primero (solución madre), echaremos 8 ml (volumen final + volumen de paso) del cromógeno azul (no lleva diluyente) con ayuda de una pipeta de 10 ml.
   c) A continuación, pasar 4 ml del primer tubo al segundo, homogeneizar por pipeteo, y seguidamente, proceder a realizar el segundo pase: 4ml del segundo tubo al tercero, homogeneizar de nuevo y volver a pasar 4 ml del tercer tubo al cuarto, homogeneizar y pasar 4 ml del cuarto al qunito tubo.
   d) Por último, desechar los 4 ml (del volumen de paso) sobrantes del quinto tubo al bote de orina, para tener el mismo volumen final .
   e) Tapar los tubos con papel Parafilm y realizar la otra batería de dilución seriada:
   -Cromógeno 2: ROJO, de concentración 600 mg/dL y cuyo factor de dilución será 1/3: Esta batería de dilución seriada consta de 4 tubos de ensayo (con 10 ml de capacidad cada uno). Se realizaría del mismo modo que el procedimiento explicado anteriormente pero en este caso, el volumen de paso sería 1'5 ml y el volumen final 3 ml; por lo que echaríamos en 3 tubos de ensayo los 3 ml de agua destilada y en el primero (solución madre) 4'5 ml del cromógeno rojo e iremos pasando 1'5 ml de tubo en tubo y finalmente desecharemos los 1'5 ml sobrantes del cuarto tubo.
3. Posteriormente, ajustaríamos los datos que nos pide el espectrofotómetro como la Tª, la longitud de onda adecuada, ...
4. Introducir la cubeta con el blanco (agua) en el espectrofotómetro y ajustar a 0 la absorbancia.
5. Medir la absorbancia de cada uno de los tubos de ambas baterías y, con los datos obtenidos, elaborar las curvas de calibración, poniendo en el eje X la concentración en mg/dL y en el eje Y, las absorbancias (A).
6. Medir la absorbancia de las muestras problema de concentración desconocida, y calcular esta con ayuda de las curvas de calibración azul y roja, aplicando el método "extrapolar", es decir, una vez realizadas las curvas con las absorbancias de las baterías realizadas previamente, medir las absorbancias de las muestras problema y en la gráfica situar el valor de las absorbancias medidas y de forma lineal, trazar una línea horizontal sobre la "curva" hasta que la línea se cruce con ésta; colocamos un punto donde se cortan y a partir de aquí, trazar una línea vertical. Ésta será la concentración de dichas muestras problema.
7. Una vez terminadas las curvas de calibración manuales, pasarlas al programa de Excell para poder tener una visualización más exacta de éstas y con ello, aprender a manejar el programa.

RESULTADOS

CROMÓGENO AZUL
Número de tubo	Absorbancia (A)	Concentración (mg/dL)
1º	1'070 A	800 mg/dL
2º	0'574 A	400 mg/dL
3º	0'272 A	200 mg/dL
4º	0'140 A	100 mg/dL
5º	0'067 A	50 mg/dL

CROMÓGENO ROJO
Número de tubo	Absorbancia (A)	Concentración (mg/dL)
1º	2'1249 A	600 mg/dL
2º	0'9097 A	200 mg/dL
3º	0'3205 A	66'67 mg/dL
4º	0'1127 A	22'22 mg/dL

La longitud de onda del blanco del cromógeno azul es 662 nm, mientras que la del cromógeno rojo es 499 nm; siendo las absorbancias de ambas 0'000 A.

MUESTRAS PROBLEMA
Cromógenos	Absorbancia (A)	Concentración (mg/dL)
Azul	1'439 A	985 mg/dL (aprox.)
Rojo	0'589 A	130 mg/dL (aprox.)

Cromógeno AZUL:

Cromógeno ROJO:

FOTOS

                                                                   

                                                         Programa "Spectra Analysis"

                                               Batería de dilución del cromógeno AZUL

                                                 Batería de dilución del cromógeno ROJO

                                                        Cubetas de espectrofotometría

                                                                  Espectrofotómetro
OBSERVACIONES
Las medidas de las absorbancias del cromógeno azul las realizamos con el espectrofotómetro y las del cromógeno rojo con el colorímetro.