5ª PRÁCTICA

PRÁCTICA Nº 5: "CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN ORINA CON ÁCIDO SULFOSALICÍLICO POR TURBIDIMETRÍA"
Fechas: 14/10/19 y 16/10/19

OBJETIVOS

• Realizar una batería de SSF (solución salina fisiológica) + Patrón de proteínas.
• Preparación del ácido Sulfosalicílico al 3% p/v.
• Realización de una batería con las diluciones de la batería previamente realizada+SSF+orina+ ácido Sulfosalicílico.

UTILIDAD CLÍNICA

• Con esta práctica fomentaremos las técnicas de pipeteo y el manejo del colorímetro con la consiguiente realización de una curva de calibración a través del programa "Excell".

FUNDAMENTO
La adición de ácido sulfosalicílico a una solución de proteínas actúa sobre estas, dando lugar, a la aparición de un fino precipitado en suspensión. Este precipitado se observa como una turbidez blanquecina cuya intensidad puede ser cuantificada por turbidimetría.
Basándonos en este método turbidimétrico vamos a cuantificar la concentración de proteínas presentes en una muestra de orina. 
La turbidimetría se utiliza fundamentalmente para soluciones problema formadas por partículas relativamente grandes. Consiste en la medida de la disminución de la intensidad de un haz de luz incidente cuando pasa a través de una suspensión de partículas con capacidad para dispersar el haz de luz. El detector del tubidimétro se encuentra en el mismo plano que la fuente de emisión (a 0º del haz incidente) y la disminución de la intensidad luminosa se puede medir como %T (transmitancia) o como A (absorbancia) en cualquier espectrofotómetro o autoanalizador de química líquida.

APARATAJE

• Colorímetro o fotómetro.

Emplean filtros de vidrio o de interferencia y obtienen luz monocromática a longitudes de onda discretas (a saltos).

MATERIALES

• Gradilla para colocar los tubos de la batería.
• 4 tubos de ensayo de 10 mL cada uno.
• 2 pipetas automáticas: una de 50 microlitros y otra de 100-1000 microlitros.
• Parafilm para tapar los tubos una vez realizada la batería de dilución.
• Una pipeta graduada de 10 mL y su auxiliar de pipeteo verde.
• Puntas de pipeta azules para la pipeta automática de 100-1000 microlitros y amarillas para la pipeta automática de 50 microlitros.
• Vaso de precipitado para echar la SSF.
  
• Probeta de 100 mL.
• Frasco y su correspondiente tapón para depositar el ácido Sulfosalicílico una vez preparado.
• Embudo.
• Tubo de orina (como contenedor de desechos).
• Frasco lavador con agua destilada.
• Báscula electrónica.
• Vidrio de reloj.
• Espátula.
• Pipeta Pasteur para enrasar.

REACTIVOS

• Suero Salino fisiológico (SSF).
• Patrón de proteínas (7 g/dl).
• Ácido 5-sulfosalicílico dihidrato.
• Agua destilada.

PROCEDIMIENTO
Realización de la batería de los 4 tubos con SSF + patrón de proteínas:

1. En primer lugar, colocar 4 tubos de 10 mL en una gradilla.
   
2. Rotularlos como D1, D2, D3 y D4.
3. Depositar 10 mL de SSF en cada uno de los 4 tubos con la pipeta graduada de 10 mL y el auxiliar de pipeteado verde.
   
   
   
   
4. Posteriormente, quitar 50 microlitros de SSF al primer tubo y añadirle 50 microlitros del patrón de proteínas. Todo ello con la pipeta automática de 50 microlitros y las puntas amarillas.
   
   
5. Al 2º tubo, quitarle 100 microlitros de SSF y añadir 100 microlitros del patrón de proteínas; con ayuda de la pipeta automática de 100-1000 microlitros ajustada a 100 microlitros y las puntas azules.
   
6. Al tercer tubo, quitarle 200 microlitros de SSF y añadirle 200 microlitros del patrón de proteínas con la misma pipeta automática de antes pero ajustada a 200.
7. Al cuarto y último tubo de esta batería de dilución, quitarle 400 microlitros de SSF y añadirle 400 microlitros del patrón de proteínas.
8. Tapar los tubos con papel Parafilm hasta el próximo día que continuemos con la práctica.
   

Preparación del ácido Sulfosalicílico:
Antes de comenzar a ello, realizaremos los cálculos necesarios previos teniendo en cuenta que queremos preparar 100 mL al 3%.

1. Pesar 3 gramos de Ácido 5-sulfosalicílico dihidrato con ayuda de una báscula electrónica. Para ello tarar la báscula con el vidrio de reloj depositado sobre ella. A continuación, depositar el ácido cuidadosamente y poco a poco con la espátula dándole golpecitos suaves por un lateral hasta llegar a la medida requerida (3 gramos).
   
   
   
   
   
   
   
2. Depositar un poco de agua destilada sobre la probeta de 100 mL con un embudo.
   
3. A continuación, echar los 3 gramos de ácido desde el vidrio de reloj a la probeta también empleando el embudo y añadir agua destilada del frasco lavador sobre éste para lavarlo y echar a la probeta la cantidad de ácido que puede haberse quedado pegado al vidrio de reloj.
   
   
   
   
   
4. Remover la disolución.
5. Seguir llenando la probeta con agua destilada hasta que quede poco para llegar a los 100 ml. Cuando llegue este momento, enrasar con una pipeta Pasteur.
   
   
   
6. Una vez terminado el proceso, depositar la disolución desde la probeta hasta un frasco y taparlo para almacenarlo hasta el próximo día. Rotular el frasco con un rotulador como Ácido Sulfosalicílico 3%.
   
   
   
   
   

CÁLCULOS de las concentraciones de la batería de dilución del SSF + Patrón de proteínas

Fecha: 16/10/19
MATERIALES

• Gradilla
• 7 tubos de ensayo de 5 ml cada uno
• Bote con una muestra de orina
• Ácido Sulfosalicílico preparado el anterior día de la práctica
• Batería de SSF + Patrón de proteínas
• Pipetas graduadas de 1ml (auxiliar de pipeteo azul) y 2 ml (auxiliar de pipeteo verde).
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas azules.
• Cubetas de fotometría y fotómetro.
• Papel para limpiar las cubetas antes de introducirlas en el espectrofotómetro.
  
  
  

REACTIVOS

• Suero Salino Fisiológico
• Ácido Sulfosalicílico al 3% (p/v) en agua destilada
• Batería de SSF + Patrón de proteínas

MUESTRA

• Orina no centrifugada

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, alicuotamos 2 ml de orina con la pipeta graduada de 2 ml y el auxiliar de pipeteo verde del bote de orina en común de toda la clase para repartirlo a cada grupo de la clase.
2. Rotular los 7 tubos de ensayo (colocados en la gradilla) como: BR o blanco de reactivo, otro como BM o blanco de muestra, cuatro más como P1, P2, P3 y P4 o patrones 1, 2, 3 y 4, y un último como PB o problema.
   
   
   
   
3. A continuación, depositar en el tubo marcado como "BR" 0'5 ml de SSF con la pipeta de 1 ml y el auxiliar de pipeteo azul.
4. Echar 2 ml de SSF en el tubo marcado como "BM".
5. 2 ml de ácido Sulfosalicílico al 3% a cada uno de los tubos que componen la batería menos en el tubo marcado como "BM".
6. Posteriormente, depositar 500 microlitros (=0'5 ml) de "D1" (de la batería realizada el anterior día de la práctica) a "P1" con una pipeta automática.
7. 500 microlitros de "D2" a "P2".
8. 500 microlitros de "D3" a "P3".
   
9. 500 microlitros de "D4" a "P4".
10. Y por último, depositar 500 microlitros de la muestra de orina al tubo de "BM" y otros 500 microlitros de orina a "PB".
    
11. Una vez realizada la batería, mediremos las absorbancias (A) de las diluciones de esta en el colorímetro. Para ello, agitaremos cada tubo de la dilución por inversión antes de medir su absorbancia en el fotómetro. A continuación, seleccionamos la longitud de onda a 660 nm  y proceder como sigue:
1. Ajustar a cero el fotómetro con el BR o blanco de reactivo.
2. Medir la absorbancia de P1, P2, P3 y P4.
3. Volver a ajustar a cero el fotómetro con el BM o blanco de muestra.
4. Medir la absorbancia del PB o muestra problema.
   Nota: todas las mediciones seguirán el mismo procedimiento, agitando en primer lugar la disolución del tubo a medir por inversión (cerrado con su correspondiente tapón para tubos de ensayo); echar en la cubeta de fotometría el contenido del tubo previamente agitado, limpiar las paredes lisas de la cubeta con papel para evitar posibles interferencias, introducir el tubo en el colorímetro, cerrar la tapa y apuntar el resultado de la absorbancia.
   

CÁLCULOS

RESULTADOS
Construir una curva de calibración a través del programa "Excell" enfrentando la absorbancia de cada tubo de la batería con sus concentraciones. Finalmente, determinar la concentración de proteínas de la muestra de orina problema trasladando a la curva el valor de absorbancia obtenido en el tubo PB.

Tubos	Absorbancia (A)	Concentración (mg/dl)
BR	0'000A	- - - -
P1	1'314 A	56 mg/dl
P2	0'721 A	28 mg/dl
P3	0'515 A	14 mg/dl
P4	0'245 A	7 mg/dl
BM	0'000 A	- - - -
PB	0'489 A	17'88 mg/dl